生化-RNA合成与加工

    第一节 dna转录生成rna

    一、定义

    （一）转录单位

    （二）启动子（promoter）

    （三）终止子（terminator）

    二、rna聚合酶

    （一）酶的特性：以4种ntp为底物，需模板和镁离子，合成方向也是5’－3’，但不需要引物。

    （二）酶的分类：

    1噬菌体的rna聚合酶结构简单，是单链蛋白，功能也简单。

    2细菌则具有复杂的多亚基结构(450kd)，可识别并转录超过1000个转录单位。

    3真核生物的酶有多种，根据a－鹅膏蕈碱(环状8肽，阻断rna延伸)的抑制作用可分为三类：聚合酶a对它不敏感，分布于核仁，转录核糖体rna；聚合酶b对低浓度敏感，存在于核质，转录信使rna；聚合酶c位于核质，对高浓度敏感，转录小分子量rna，如转运rna、5srna等。各种rna聚合酶都是由10-15种不同亚基组成的多亚基复合物。

    4 线粒体和叶绿体也有rna聚合酶，结构简单，能合成所有种类rna。

    （三）酶的构成：大肠杆菌的全酶有5个亚基（α2ββ’wσ），含2个锌。β催化形成磷酸二酯键，β’结合模板，σ亚基称为起始因子，可使rna聚合酶稳定地结合到启动子上。ββ’wσ称为核心酶。σ亚基在不同菌种间变动较大，而核心酶比较恒定。酶与不同启动子的结合能力不同，不同启动因子可识别不同的启动子。σ70识别启动子共有序列，σ32识别热休克基因，σ60在氮饥饿时起作用。σ通过随机移动起作用，不需解链。

    （四）模板：以完整双链dna为模板，其中仅一条链可转录。转录时局部解链，转录后dna重新形成双螺旋结构，所以dna是全保留的。

    三、转录过程

    分为起始、延长和终止三个阶段。起始包括对双链dna特定部位的识别、局部（17bp）解链以及在最初两个核苷酸间形成磷酸二酯键。第一个核苷酸掺入的位置称为转录起点。

    起始后起始因子离开，核心酶构象改变，沿模板移动，转录生成杂交双链(12bp)，随后dna互补链取代rna链，恢复dna双螺旋结构。延伸速度为50nt/s，酶移动17nm。错误几率为10-5。

    聚合酶到达终点时，在终止辅助因子的帮助下停止反应，酶和rna链脱落，转录结束。

    四、启动子和转录因子

    （一）定义：酶识别、结合、开始转录的一段dna序列。强启动子2秒钟启动一次转录，弱启动子10分钟一次。

    （二）原核生物：大肠杆菌在起点上游约－10碱基对处有保守序列tataat，称为pribnow box，有助于局部解链。在其上游还有ttgaca，称为－35序列，提供rna聚合酶识别的信号。

    （三）真核生物：复杂，差异较大。

    1信使rna的启动子通常有三个保守区，－25到－30有tata框，是解链位置，并决定转录起点；－75位置有caat框，与rna聚合酶的结合有关；更上游还有gc框，某些转录因子可结合。后两个称为上游因子，对转录起始频率有较大影响。

    2 小rna的启动子在转录区内部，有一些辅助因子帮助rna聚合酶识别。

    五、终止子和终止因子

    （一）定义

    （二）所有原核生物的终止子在终点之前都有一个回文结构，可使酶减慢移动或暂停合成。大肠杆菌有两类终止子：

    1 简单终止子，回文区有一段富含gc对的序列，回文后有寡聚尿苷。

    2依赖p的终止子，必须在有p因子时才能发挥作用，不含gc对，也无寡聚尿苷。p因子是蛋白质，可与酶作用，释放rna，并使酶脱离。

    （三）某些因子可使酶越过终止子继续转录，称为通读。常见于某些噬菌体的时序控制，早期基因与晚期基因以终止子相隔，早期基因产生抗终止因子，使发生通读以表达晚期基因。

    六、转录的调控

    （一）遗传信息的表达有时序调控和适应调控，转录水平的调控是关键环节，因为这是表达的第一步。转录调控主要发生在起始和终止阶段。

    （二）操纵子是细菌基因表达和调控的单位，有正调节和负调节因子。阻遏蛋白的作用属于负调控。环腺苷酸通过其受体蛋白（crp）促进转录，可促进许多诱导酶的合成。操纵子可构成综合性调控网络，如sos反应等。对终止子也有调控作用，如衰减子。

    （三）真核生物不组成操纵子，而是通过激素、生长因子等进行调控。某些dna序列对转录起增强作用，称为增强子。

    第二节 转录后加工

    一、原核生物

    （一）核糖体rna：大肠杆菌共有7个核糖体rna的转录单位，每个转录单位由16s、23s、5srna和若干转运rna基因组成。16s和23s之间常由转运rna隔开。转录产物在rna酶iii的作用下裂解产生核糖体rna的前体p16和p23，再由相应成熟酶加工切除附加序列。前体加工时还进行甲基化，产生修饰成分，特别是a-甲基核苷。n4,2’-o二甲基胞苷(m4cm)是16s核糖体rna特有成分。5s核糖体rna一般无修饰成分。

    （二）转运rna：有60个基因，其加工包括：

    1内切酶在两端切断，大肠杆菌rna酶p是5’成熟酶

    2外切酶从3’修剪，除去附加顺序。rna酶d是3’成熟酶

    33’端加上ccaoh，由转运rna核苷酰转移酶催化，某些转运rna已有，切除附加序列后即露出。

    4核苷的修饰：修饰成分包括甲基化碱基和假尿苷，修饰酶具有高度特异性。甲基化对碱基和序列都有严格要求，一般以s-腺苷甲硫氨酸为甲基供体。

    （三）信使rna：细菌多数不用加工，转录与翻译是偶联的。也有少数多顺反子信使rna必须由内切酶切成较小的单位，然后翻译。如核糖体大亚基蛋白与rna聚合酶的b亚基基因组成混合操纵子，转录后需经rna酶iii切开，各自翻译。因为rna聚合酶的合成水平低得多，切开有利于各自的翻译调控。较长的rna会产生高级结构，不利于翻译，切开可改变其结构，从而影响其功能。

    二、真核生物

    （一）核糖体rna：基因拷贝数多，在几十到几千之间。基因成簇排列在一起，由rna聚合酶i转录生成一个较长的前体，哺乳动物为45s。核仁是其转录、加工和装配成核糖体的场所。rna酶iii等核酸内切酶在加工中起重要作用。5srna基因也是成簇排列的，由rna聚合酶iii转录，经加工参与构成大亚基。核糖体rna可被甲基化，主要在核苷2’羟基，比原核生物甲基化程度高。多数核糖体rna没有内含子，有些有内含子但不转录。

    （二）转运rna：由rna聚合酶iii转录，加工与原核相似，但3’端的cca都是后加的，还有2’-o-甲基核糖。

    （三）信使rna：真核生物编码蛋白质的基因以单个基因为转录单位，但有内含子，需切除。信使rna的原初转录产物是分子量很大的前体，在核内加工时形成大小不等的中间物，称为核内不均一rna(hnrna)。其加工过程包括：

    15’端加帽子：在转录的早期或转录终止前已经形成。首先从5’端脱去一个磷酸，再与gtp生成5’，5’三磷酸相连的键，最后以s-腺苷甲硫氨酸进行甲基化，形成帽子结构。帽子结构有多种，起识别和稳定作用。

    2 3’端加尾：在核内完成。先由rna酶iii在3’端切断，再由多聚腺苷酸聚合酶加尾。尾与通过核膜有关，还可防止核酸外切酶降解。

    3 内部甲基化：主要是6-甲基腺嘌呤，在hnrna中已经存在。可能对前体的加工起识别作用。

    三、rna的拼接

    （一）转运rna的拼接：由酶催化，酶识别共同的二级结构，而不是序列。通常内含子插入到靠近反密码子处，与反密码子配对，取代反密码子环。第一步由内切酶切除插入序列，不需atp；第二步由rna连接酶连接，需要atp。

    （二）四膜虫核糖体rna的拼接：某些四膜虫26s核糖体rna基因中有一个内含子，其拼接只需一价和二价阳离子及鸟苷酸或鸟苷存在即可自发进行。其实质是磷酸酯的转移反应，鸟苷酸起辅助因子的作用，提供游离3’羟基。

    （三）信使rna：真核生物编码蛋白质的核基因的内含子属于第二类内含子，左端为gt，右端为ag。先在左端切开，产生的5’末端与3’端上游形成5’,2’-磷酸二酯键，构成套索结构。然后内含子右端切开，两个外显子连接起来。通过不同的拼接方式，可形成不同的信使rna。

    第三节 rna的复制

    一、噬菌体qbrna的复制

    其rna是单链，正链，侵入大肠杆菌后立即翻译，产生复制酶的b亚基，与宿主的三个亚基(α为核糖体蛋白，γ、δ均为肽链延长因子)构成复制酶，进行复制。先以正链为模板合成负链，再根据负链合成正链。合成负链时需要宿主的两个蛋白因子，合成正链则不需要，所以可大量合成。病毒的蛋白质合成受rna高级结构的调控。

    二、病毒rna复制的主要方式

    （一）病毒含正链rna，先合成复制酶，复制后合成其他蛋白质进行装配。如噬菌体qb及灰质炎病毒。

    （二）病毒含负链和复制酶，先合成正链，再合成病毒蛋白和复制病毒rna。如狂犬病毒。

    （三）病毒含双链rna和复制酶，如呼肠孤病毒。先复制正链，再翻译成病毒蛋白，最后合成负链，形成双链rna分子。

    （四）致癌rna病毒：如白血病病毒和肉瘤病毒，先逆转录生成dna前病毒，再转录、翻译。

    第四节 rna生物合成的抑制剂

    一、碱基类似物

    有些人工合成的碱基类似物能干扰和抑制核酸的合成。作用方式有以下两类：

    （一）作为代谢拮抗物，直接抑制核苷酸生物合成有关酶类。如6-巯基嘌呤进入体内后可转变为巯基嘌呤核苷酸，抑制嘌呤核苷酸的合成。可作为抗癌药物，治疗急性白血病等。此类物质一般需转变为相应的核苷酸才能表现出抑制作用。

    （二）进入核酸分子，形成异常rna或dna，影响核酸的功能并导致突变。5-氟尿嘧啶类似尿嘧啶，可进入rna，与腺嘌呤配对或异构成烯醇式与鸟嘌呤配对，使a-t对转变为g-c对。因为正常细胞可将其分解，而癌细胞不能，所以可选择性抑制癌细胞生长。

    二、dna模板功能抑制物

    （一）烷化剂：带有活性烷基，能使dna烷基化。鸟嘌呤烷化后易脱落，双功能烷化剂可造成双链交联，磷酸基烷化可导致dna链断裂。通常有较大毒性，引起突变或致癌。

    （二）放线菌素类：可与dna形成非共价复合物，抑制其模板功能。包括一些抗癌抗生素。

    （三）嵌入染料：含有扁平芳香族发色团，可插入双链dna相邻碱基对之间。常含丫啶或菲啶环，与碱基大小类似，可在复制时增加一个核苷酸，导致移码突变。如溴乙啶。

    三、rna聚合酶抑制剂

    （一）利福霉素：抑制细菌rna聚合酶活性。

    （二）利链菌素：与细菌rna聚合酶b亚基结合，抑制rna链的延长。

    a-鹅膏蕈碱：抑制真核生物rna聚合酶。